小反刍兽疫研究进展
摘要：小反刍兽疫病毒是副黏病毒科麻疹病毒属的成员，主要感染山羊、绵羊等小反刍动物，引起一种高度接触性病毒性传染病。临床症状主要以消化道和呼吸道最为明显，与犬瘟热症状极为相似。该病具有高发病率和高死亡率等特点，给很多国家的养羊业造成了巨大的经济损失。本文从该病的病原学、临诊症状、病理变化、诊断方法与疫苗研究等几个方面进行了综述，以期为广大兽医工作者对该病的有效防控提供有益的参考。
关键词：小反刍兽疫疫苗诊断
小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的一种高度接触性病毒性传染病，主要感染山羊、绵羊等小反刍动物，其中山羊高度易感。小反刍兽疫主要通过直接和间接接触传染或呼吸道飞沫传染，潜伏期为4d~5d。在易感群中，严重暴发时致死率为%，中等暴发时致死率不超过50%。山羊高度易感，绵羊次之。PPRV是副黏病毒科麻疹病毒属的成员，但只有１个血清型，根据PPRV核衣壳蛋白（N蛋白）和融合蛋白（F蛋白）基因序列可分为４个谱系，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系起源于非洲，Ⅳ系起源于亚洲。PPR主要侵害淋巴组织和呼吸道、消化道上皮细胞，在临床上主要表现为突然发热、坏死性口炎、支气管肺炎和肠炎等症状，严重病例多以死亡告终。
小反刍兽疫首次发现于西非的科特迪瓦，主要分布在撒哈拉沙漠以南及赤道以北的非洲国家，近年来，几乎遍及所有中东、西亚、南亚国家，在我国周边国家和地区多呈地方性流行。我国年首次于西藏发现小反刍兽疫，年底该病从境外再次传入新疆，年在全国22个省（自治区）暴发，造成较大经济损失。根据农业部兽医局通报，截至年4月，我国西藏、新疆、甘肃、内蒙古、宁夏、湖南、辽宁、江西、安徽、江苏和重庆等20个省、自治区、直辖市发生PPR疫情。其中西藏最早，年底在新疆发生，年1月至3月间，甘肃、内蒙古、安徽和重庆等多个省份发生PPR疫情，总体走向为由西至东。我国早期的PPR疫情均发生于中国边境地区，可能与周边国家发生该疫情有很大关系，野生动物很容易穿越边境进入中国，与中国接壤的PPRV感染国，其家养小反刍兽也容易通过交通运输将PPRV传入我国。本文从病原学、临床表现、病理变化、诊断方法、疫苗研制等若干方面对该病的流行及研究概况进行了阐述和概括。
1病原学研究进展
PPRV呈多形性，大多为直径-nm的圆形或椭圆形。PPRV为囊膜病毒，位于囊膜表面的纤突由病毒融合蛋白和血凝素2种糖蛋白形成。对PPRV感染宿主细胞具有至关重要的作用。PPRV的基因组为不分节段的单股负链RNA，RNA链从3′到5′依次是N－P／C／V－M－F－H－L8个基因，分别编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白。
1.1N和P蛋白核衣壳蛋白（N）包含一个开放的阅读框架（ORF），编码个氨基酸残基，是PPRV中含量最丰富和免疫原性最强的病毒蛋白，含有一个位点，能够诱导产生受Ⅰ型MHC分子限制的CTL反应，主要功能是参与病毒的转录和翻译过程并保护病毒免受RNA核糖核酸酶Ⅰ的降解。N蛋白结构可分为氨基末端区（Ⅰ区）、-AA区（Ⅱ区）、蛋白的中部区（Ⅲ区）、-的羧基末端区（Ⅳ区）。Buckload等研究发现，所有针对麻疹病毒属成员的N蛋白的单克隆抗体对应的表位大多在Ⅳ区，N蛋白的C端多暴露在外面，有可能与囊膜蛋白相连接；磷蛋白（P）最不保守，共含有个氨基酸，由于在加工过程中形成大量的磷酸盐残基，而在聚丙烯凝胶电泳中显示的条带和原条带相差23ku左右。P蛋白是RNA聚合酶复合物中的辅助因子，协助大蛋白（L）的折叠，维持N蛋白在细胞质中的可溶状态，从而阻止其不正常装配或与特异性RNA结合。此外，P基因还编码C和V两种非结构蛋白。
1.2M蛋白囊膜基质蛋白（M）为病毒囊膜内层的主要成分，全长个核苷酸，编码个氨基酸，带正电荷，Arg/Lys的含量为13%。有研究表明，M、H和F蛋白是RPV-PPRMFH融合蛋白疫苗成功的关键。M蛋白在促进成熟病毒粒子释放中起到了决定性的作用，若PPRV缺乏该蛋白，则会失去感染细胞的能力。
1.3F蛋白纤突糖蛋白（F）是一种融合蛋白，含有个氨基酸，5’端序列具有病毒特异性，PPRV的各种毒株依据F蛋白基因序列的遗传特性而分为4个群。F蛋白的作用是帮助病毒进入宿主细胞。一旦病毒吸附到宿主细胞的靶位，F蛋白就调节病毒膜和细胞膜的融合，并允许直接释放的N蛋白进入细胞浆。在病毒感染过程中，新合成的融合蛋白分子使细胞间发生融合。所以，抑制F蛋白的活性，对防止副黏病毒感染是十分重要的。
1.4H蛋白血凝素蛋白（H）是构成病毒的另一种纤突，同时具有血凝素和神经氨酸酶活性，含有T细胞抗原决定簇，虽然含有血凝素，但不能凝集绵羊、山羊、牛、猴子、犬等哺乳动物和禽类的红细胞，其主要作用是连接宿主细胞和病毒。
1.5L蛋白大蛋白（L蛋白）在麻疹病毒属是最长的一个蛋白，PPRV的L蛋白由个氨基酸组成，L蛋白是一个多功能蛋白，同时发挥着病毒RNA聚合酶和转录酶的功能，此外，其还具帽化、甲基化和多聚腺苷酸化的作用，只有在结合了其辅助分子—P蛋白之后，L蛋白才具有RNA聚合酶的活性。在L蛋白的N末端有一个保守区，通过对MV和RPV的研究已经证实了这一区域是P蛋白的结合位点。麻疹病毒属的L蛋白共有3个高度保守的域，被2个变异程度较高的铰链区分开。除了与P蛋白结合的第1个区域，第2个区域位于氨基酸—处，被认为是RNA聚合酶的功能区，位于氨基酸—的第3个区域具有激酶活性而且很可能是ATP的结合位点。
2临床表现
PPR是小反刍兽以发热、眼鼻有分泌物、口炎、腹泻和肺炎为特征的急性病毒病。该病潜伏期一般为4～5d，最长21d，《陆生动物卫生法典》规定为21d，临床症状和牛瘟相似，但只有山羊和绵羊感染后才出现症状，感染牛则不出现临床症状。山羊临床症状比较典型，一般分为温和型、标准型和急性型。温和型症状轻微，发热类似感冒症状。标准型发热体温可达40～41℃，持续3～8d，口鼻分泌物增加，严重腹泻，有时出现口腔溃疡，有时表现支气管肺炎，似羊支原体肺炎。急性型体温可升至41℃以上，持续3～5d。发热1～2d后病畜精神沉郁，食欲减退，体重下降，鼻镜干燥，口鼻腔分泌物逐渐变成浓性黏液。发热开始的4d内，口腔黏膜先是轻微充血及出现表面糜烂，大量流涎，坏死通常首发于牙床下方黏膜，其后坏死现象迅速向牙龈、硬腭、颊、口腔乳突、舌等黏膜蔓延。坏死组织脱落，出现不规则且浅的糜烂斑。如果病畜不死，这种症状可持续14d。如同其他动物传染病，首次入侵时，所有易感羊群即大暴发本病，部分口腔病变的羊，2d内痊愈，这些羊可能恢复，其他病羊后期出现带血水样腹泻、严重脱水、消瘦、怀孕羊流产，随之体温下降，因二次细菌性感染出现咳嗽、呼吸异常，发病率可达%。幼年动物发病率和死亡率都很高。本病一旦常在后，变为散发，随季节性羊羔的出生而病例增加。
3病理变化
小反刍兽疫引发的病变比较明显，在肺脏主要有炎性渗出液或纤维素性渗出物，肺脏常伴有水肿和气肿。心脏主要表现为病羊心包有黄红色浑浊液体，质地变软，色泽变淡。冠状沟周围及心尖有不等程度的出血，严重时整个心表面及内膜下密布斑点状或条纹状出血。肝脏不同程度的肿大、淤血、出血，肝表面与切面有针尖至米粒大小灰白色或黄白色病灶呈散在或弥漫性分布。胆囊肿胀，胆汁淤积。脾脏也有不同程度的肿大、淤血，质地较软，表面与切面可见针尖至粟粒大小灰白色或黄白色病灶呈散在或弥漫性分布。部分病例腹腔积液，瘤胃、网胃和瓣胃黏膜不同程度充血。皱胃不同程度出血。肠粘膜有溃疡灶，伴有充血、出血，甚至呈条纹状出血。肠淋巴滤泡明显肿大、突出，部分肿大的肠淋巴滤泡坏死形成溃疡，尤以小肠明显。肠系膜淋巴结不同程度肿大、充血，切面湿润，有的切面也见针尖大小黄白色病灶散在。肾脏不同程度淤血、出血，切面皮质增宽，色黄、质脆。胰脏淤血、出血。
4诊断方法
根据小反刍兽疫的流行病学特点、临床症状和病理变化等，可作出初步诊断。但应注意与巴氏杆菌病、传染性羊胸膜肺炎、羊传染性脓疱、蓝舌病和口蹄疫等作鉴别诊断。本文主要介绍本病的实验室诊断方法。
4.1常规诊断PPR的常规诊断技术主要有琼脂免疫扩散试验（AGID）、病毒分离鉴定和胶体金试纸条等。
AGID的敏感性相对较低，因此基本不会用于标准诊断。血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）仍可用于日常监测，此两种技术易操作、花费少、敏感性也相对较高。
病毒分离培养通常采用非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）进行。Sreenivasa等于年，研究发现改造过的狨猴B淋巴细胞衍生细胞系MarmosetB95a细胞更利于PPRV的繁殖和分离。应用此方法鉴定比较准确，但相对费时费力，不适用于PPRV的快速检测。
在胶体金试纸条方面，研究者成功地建立了一种特异、快速检测PPRV抗原胶体金免疫层析试纸条。此方法与病毒分离方法相比，缩短了PPRV抗原检测时间、降低了检测成本和检测环境要求，是PPRV检测方法的完善，也是PPR快速准备诊断方法之一。
4.2抗原学诊断抗原学诊断主要包括特异性的cDNA探针杂交、RT-PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）、RT-PCR-ELISA和抗原捕获ELISA等。具体方法本文将不做详细的介绍。
4.3血清学诊断PPRV抗体血清学诊断方法包括间接荧光抗体试验（IFAT）、对流免疫电泳试验（CIEP）、病毒中和试验（VNT）和ELISA等。其中，IFAT和VNT虽然是鉴别诊断PPRV和RPV的可靠方法，但由于此两种方法操作复杂、耗时长、设备要求高，不适于大量样品的检测；而VNT是国际贸易中要求进行的一项检测试验，该法灵敏度高、特异性强，但十分耗时。ELISA方法相比上述几种方法更加方便、快捷，适用于大量样品的检测诊断。
5疫苗的研究进展
近年来，利用分子生物学和反向遗传学技术，国内外研究者对PPR基因工程标记疫苗进行了不懈探索，以不同的病毒为载体已构建了多种PPR基因工程疫苗。PPR弱毒疫苗依然是目前唯一被批准用于临床的PPR疫苗。
5.1小反刍兽疫弱毒疫苗年，Diallo等通过Vero细胞的连续传代，成功研制了Nigeria75/1PPR弱毒疫苗，该疫苗无任何副作用。至今，弱毒疫苗Nigeria75/1仍是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗。我国于年7月首次在西藏地区发生小反刍兽疫疫情，于年10月生产出第一批小反刍兽疫活疫苗Nigeria75/1株，用于西藏和新疆部分地区的紧急免疫。印春生等通过对该疫苗进行临床应用研究，结果表明该疫苗在田间大规模使用是安全有效的，疫苗具有良好的免疫原性和较长的免疫持续性同其他的副黏病毒一样，小反刍兽疫病毒对热非常敏感，这成为了在热带疫区使用活毒疫苗最大的障碍，且在这些地区基础设施较为落后，难于实现疫苗的低温运输和保存，为克服这一障碍，Worwall等通过添加含海藻糖的稳定剂研制出了热稳定性冻干疫苗，该疫苗能够在45℃条件下保存14天，这种热稳定性疫苗对小反刍兽疫的防控起到了很大的作用。
5.2灭活疫苗小反刍兽疫灭活疫苗采用感染山羊的病理组织制备，一般采用甲醛或氯仿灭活。用甲醛灭活的疫苗免疫效果不理想，而用氯仿灭活的疫苗效果较好。
5.3基因工程疫苗基因重组疫苗是将小反刍兽疫病毒的F基因插入减毒痘病毒的TK基因编码区，可以构建重组羊痘病毒疫苗。重组二价疫苗既可抵抗强毒的攻击感染，同时也能预防羊痘病毒的感染。除了上述基因工程疫苗外，近年来研究者在基因工程疫苗方法也取得了突破性的进展。例如王芳等选用腺病毒活病毒载体，插入人工合成密码子优化的小反刍兽疫病毒H基因，成功构建了表达小反刍兽疫病毒H基因的复制缺陷性重组人腺病毒载体疫苗候选株。
5.4其它近年来有很多不同类型的疫苗已经商业化，例如嵌合体疫苗，该疫苗不仅可以对PPRV产生完全的保护力，而且免疫动物血清中无特异的RPVELISA抗体，排除了疫苗免疫对RPV的血清学干扰。其次还有活载体疫苗、核酸疫苗、植物疫苗等。不管哪种疫苗都为该病的预防提供了强有力的保障。
6小结
PPR已经严重影响了我国羊养殖业，制约着羊养殖业的持续健康发展，近期中国多地暴发PPR疫情为我们敲起了警钟。本文通过从该病的病原、临床症状、病理变化等多方面进行总结发现，PPR尚无有效的治疗方法，现今最佳的方法是通过免疫接种疫苗来抵御此病的发生。通过对PPRV病原学的分析，建立和创造更多的防控方法成为当今科研的重中之重。虽然已有的多种新型疫苗，并在PPR的预防方面展现出较好的效果，但力求高效的疫苗成为科研工作的发展目标。在做好科研工作的前提也要加强对抵抗和防御外来病的宣传和教育，从源头防止此病的发生。
研发部李小明
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