摘要：干扰素(IFN)是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分。本文主要叙述了干扰素的诱生和功能研究，对牛IFN-α、IFN-γ和IFN-τ的生物学特性及应用研究进行概括综述。
关键词：干扰素；作用机理；牛干扰素
本文作者：张弦缪德年张克春（上海市奶牛研究所，上海）
干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能的细胞因子，能通过多种机制影响肿瘤细胞生长，促进免疫细胞活性，最早由英国病毒学家Issacs和瑞士研究者Lindemann在伦敦国立医学研究所研究病毒干扰试验中发现。基于其蛋白家族的基因序列、受体特异性和染色体定位，干扰素主要分为3类，,即型I、II型和III型干扰素。I型干扰素有多种亚型且各亚型间都具有一定的结构同源性，包括IFN-α、β、δ、ε、κ、τ等，其中人类IFN-α可以分为13个不同亚型，IFN-τ只能由绵羊、牛、山羊等反刍动物孕体滋养层细胞分泌。II型干扰素由单基因家族IFN-γ构成,又称为免疫干扰素。
1干扰素诱生和功能
1.1干扰素的诱生
干扰素属于诱生蛋白，由于细胞DNA中存在干扰素的基因抑制物，故细胞在正常情况下不会生成干扰素。病毒体的各种病原相关分子模式（ViralPAMPs）经受体细胞识别后，通过不同的信号衔接蛋白激活多种蛋白激酶（Kinases），从而对特定的转录因子（TranscriptionFactors）或其调节蛋白进行磷酸化修饰，导致转录因子可以从细胞质进入到细胞核内。这些转录因子可以结合干扰素基因启动子上的相关效应元件，最终激活干扰素基因或干扰素效应基因的转录。目前干扰素诱生研究较多的是Toll样受体（Toll-likereceptor，TLR）机制和RLG-I样受体（RIG-Ⅰ-likereceptor，RLR）机制。这两类受体的主要识别对象为病毒核酸（包括单链和双链RNA）。
1.2干扰素抗病毒功能
干扰素在与靶细胞的细胞表面受体结合后可以激活靶细胞内潜在抗病毒基因的表达，产生具有酶活性的抗病毒蛋白（AntivirualProtein，AVP），使细胞具备抗病毒的能力，降低病毒在细胞内的增殖速度，同时减少细胞感染的损伤。目前已经掌握的抗病毒蛋白（AVP）包括：2-5寡腺苷酸合成酶（OAS）、蛋白激酶R(PKR)、内核酶L（RNaseL）、Mx蛋白、GTPases、RNA特异性腺苷脱氨酶（ADAR）等。
在医学上，干扰素已经在临床广泛用于各类病毒性疾病的治疗，如乙型肝炎、丙型肝炎、西尼罗河病毒感染等。IFN-α2b还作为预防SARS的技术储备药物。
研究表明，禽干扰素ChIFN-α对新城疫病毒（NDV）、马立克氏病病毒（MDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）等病毒性疾病具有较好的良好辅助治疗的效果。犬干扰素在临床中已经广泛运用于病毒性疾病的辅助治疗，包括：犬冠状病毒、犬瘟热、犬细小病毒等。牛干扰素对于许多病毒性疾病都有很好的预防效果，牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒。牛副流感病毒-3型等在体外实验中对重组牛干扰素都非常敏感。重组BoIFN-α可以显著提高犊牛的免疫调节能力，降低犊牛呼吸道疾病的死亡率。
1.3干扰素的抗肿瘤功能
实验证明，干扰素在体内外都能表现出控制肿瘤生长、抑制肿瘤复发转移的功能。干扰素的抗肿瘤作用主要表现为：抑制肿瘤细胞的增殖；改变肿瘤细胞表面性能，从而诱发生成新的抗肿瘤抗体；通过免疫调节机制增强机体的抗肿瘤能力。IFN-α可以增强机体免疫系统杀灭肿瘤的能力，抑制肿瘤细胞的增殖能力，并可以改变肿瘤细胞的细胞膜性质，增强肿瘤NK细胞的杀伤能力，有利于抑制、杀灭肿瘤细胞。IFN-γ在机体肿瘤发生、肿瘤抑制排斥和肿瘤免疫检测过程中起着重要的作用。在医学上，各类干扰素已经广泛用于肿瘤的临床治疗，如膀胱癌、卵巢癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、肾细胞癌、AIDS相关Kaposi肉瘤等。
1.4干扰素的免疫调节功能
干扰素除了有抗病毒和抗肿瘤的功能外还具有强大的免疫调节作用。I型干扰素主要通过对淋巴细胞和巨噬细胞的调节以及诱导MHCI型分子的表达来实现对机体的免疫调节。IFNα/β可以诱导淋巴细胞释放肿瘤坏死因子，启动NK细胞和细胞毒性T细胞的分化，增强巨噬细胞吞噬抗原能力等。然而相对而言，IFN-γ的免疫调节能力更为强大。IFN-γ是特异性抗原或有丝分裂原刺激机体后，主要由CD4+Th1细胞、CD8+T细胞及NK细胞等所分泌表达的一种细胞因子，可以显著增加病毒感染细胞和抗原提呈细胞表达MHCII型分子，增强其与T淋巴细胞的相互作用，进而增强T淋巴细胞辅助抗体表达和协助细胞毒性T细胞生成的能力。IFN-γ可以诱导巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、星状细胞等MHCII类抗原的表达，使其参与抗原提呈与特异性免疫的识别过程。机体IFN-γ水平直接反映了机体的细胞免疫状态。IFN-γ作为免疫佐剂，可以增强疫苗的免疫效果。
1.5干扰素对生殖的作用
I型干扰素中的IFN-τ同样具有一定的抗病毒、抗肿瘤细胞增殖和免疫调节作用，但其在机体内最重要的功能为促进妊娠识别。IFN-τ基因在反刍动物中仅存在于绵羊、山羊、牛、羚羊、鹿和长颈鹿的基因组中，在鼠的基因组中也发现了IFN-τ。IFN-τ由胚胎滋养层细胞合成分泌，其作为一个旁分泌因子抑制PGF2α的表达，阻止了黄体的溶解，而黄体功能的存在是胚胎在母体内继续发育的先决条件。对IFN-τ的研究已经成为胚胎生物工程中的热点。
2牛干扰素研究概括
随着奶牛集约化养殖程度的不断提高，奶牛传染性疾病的发病率也在逐年上升。口蹄疫（FMD）、牛传染性鼻气管炎（IBR）、牛病毒性腹泻（BVD）等病毒性疾病在许多国内规模化牧场长期流行，给奶牛养殖者带来巨大的风险和损失。实验证明牛干扰素可以抑制多种病毒增殖，有效增强机体免疫力，临床应用前景巨大。目前国内外对牛干扰素的研究主要集中在BoIFN-α、BoIFN-γ和BoIFN-τ。BoIFN–α属于I型干扰素，主要由白细胞生成。IFN-γ是由致敏T细胞（Th1细胞和NK细胞等）在获得病毒等干扰素诱生剂和某些细胞因子作用下所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。IFN-γ常用于疫苗佐剂，其主要是诱导MHC-Ⅱ的表达。且当IFN-γ与抗原在同一位置同时使用时，佐剂效果最好。
2.1牛-α干扰素（Bovineinterferonalpha，BoIFN-α）
BoIFN-α全基因共个碱基编码一个开放阅读框，个氨基酸，其中前23个氨基酸编码为其信号肽，后个氨基酸组成其成熟多肽。BoIFN-α在第1、29、98、位具有保守的半胱氨酸，可形成2个分子内二硫键（Cys1-Cys98，Cys29-Cys），其中第二个二硫键为BoIFN-α抗病毒活性所必须。Velan在年最先以HuIFN-α基因为探针从牛cDNA文库中克隆了BoIFN基因，并测序了其中的四个亚型。研究表明，BoIFN-α在体外具有抗水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻等多种病毒的作用。BoIFN-α的抗病毒和多种免疫调节功能，使其在临床上具有巨大的应用前景。然而由于BoIFN-α的产量和活性问题，临床使用的情况极为少见，目前还主要停留在实验室研究阶段。葛金英等在新城疫病毒LaSota疫苗株中高效稳定表达牛α干扰素，抗病毒活性为2×IU。王延群通过人工合成BoIFN-α基因，并将目的基因克隆至表达载体pPIC9K中，电转化于毕赤酵母菌株GS中，诱导表达获得高活性的BoIFN-α。李学仁采用毕赤酵母系统表达出具有生物学活性的BoIFN-α，活性为4.1×U/mL。
2.2牛-γ干扰素（BovineInterferongamma，BoIFN-γ）
BoIFN-γ全基因共个碱基，编码个氨基酸，其中的前23个氨基酸为信号肽，后个氨基酸组成其成熟多肽，在第25位和97位的谷氨酰胺存在两个潜在的糖基化位点，相对分子质量约为19kD。编码分泌蛋白的mRNA在翻译时首先合成N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，在在信号肽的引导下，BoIFN-γ经由内质网膜中的蛋白质孔道到达内质网内腔，随后信号肽被酶水解，BoIFN-γ被分泌到胞外。BoIFN-γ具有较强的免疫增强功能，可以用作疫苗佐剂。近年来研究的重点主要集中在BoIFN-γ的释放试验，该试验是牛结核病体外免疫检测的新技术，操作简单，特异性和灵敏性高，可以代替牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验，对于牛群结核病的防控具有重大意义。史喜菊在大肠杆菌与毕赤酵母中成功表达了牛γ干扰素，而毕赤酵母表达的蛋白抗病毒活性高于大肠杆表达蛋白，约为前者的2倍。冯向辉等在CHO细胞中表达了牛γ干扰素，并建立起了基于BoIFN-γ的牛结核杆菌的检测。王海春构建表达了牛γ干扰素的重组杆状病毒，应用Sf21细胞悬浮培养技术大量表达γ干扰素，抗病毒活性为1.05×IU/mg。徐正中、陈祥等，在Sf9昆虫细胞体系中成功表达牛γ干扰素，并基于此建立牛结核病的ELISA检测方法，临床试验表明，该方法较单纯皮试变态反应有较高的检出率和特异性。
2.3牛-τ干扰素（BovineInterferontau，BoIFN-τ）
BoIFN-τ与BoIFN-α、BoIFN-β同属于Ⅰ型干扰素，在氨基酸序列上，BoIFN-τ与BoIFN-α、IFN-β之间的同源性分别为50%、30%，与BoIFN-γ的同源性较低。BoIFN-τ由个核苷酸编码，蛋白质前体由个氨基酸组成，其中前23个氨基酸组成具有高保守性的信号肽序列，成熟蛋白由个氨基酸编码。BoIFN-τ已经成为胚胎生物工程研究的热点，因为其是牛孕体向母体发出的最早的胚源性妊娠信号，可有效抑制黄体溶解进而维持孕酮分泌来维持后续的妊娠过程，在妊娠识别和胚胎植入过程中发挥极其重要的作用。研究者们希望通过对BoIFN-τ作用机理的研究，来提高奶牛繁殖力，增加胚胎移植成功率，减少流产发生。BoIFN-τ天然产量低，且提取和纯化BoIFN-τ步骤繁琐产率低，从而限制了BoIFN-τ的研究和应用，因而利用基因工程技术生产BoIFN-τ具有重要的意义。高方方、张谊分别采用pET-30a（+）和pET-28a（+）表达载体在大肠杆菌系统中成功表达了具有活性的rBoIFN-τ。管晓斌采用克隆测序技术，首次测定了中国荷斯坦奶牛干扰素τ成熟蛋白基因的编码区（CDS）全序列，并将BoIFN-τ基因克隆至pET-28a（+）载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，获得rBoIFN-τ。
3结语
干扰素以其广谱的抗病毒活性和广泛的免疫调节能力决定了其具有巨大的临床应用潜力，可以用来预防和治疗牛病毒性疾病。随着基因工程技术的发展，人工大量生产牛干扰素已经成为可能，从而大大降低了干扰素的生产成本，相信不远的将来，牛干扰素将在病毒性疾病的防控上发挥重要作用。
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